بررسی بیان افتراقی ژن های قارچ تریکودرما در طول کلونیزاسیون اسپرموسفر و ریزوسفر گوجه فرنگی با ارزیابی پروفیل های نسخه برداری

بعضی از استرین‏های تریکودرما به عنوان عوامل کنترل بیولوژیک بر علیه بیمارگر‏های گیاهی استفاده شده است. توانائی گونه‏های تریکودرما جهت کلونیزه کردن و استقرار یافتن در ریزوسفر یک نیاز ضروری برای آن‏هاست که قادر باشند بیمارگر‏های ریشه را کنترل کنند، مقاومت گیاهی را القاء کنند و رشد گیاهی را افزایش دهند. شناسائی ژن‏هائی از تریکودرما که بیان آن‏ها در طول مراحل اولیه‏ی برهمکنش با ریشه‏های در حال توسعه بذور جوانه‏زده تغییر می‏کند مرحله‏ی مهمی جهت درک قابلیت تسخیر‏کنندگی ریزوسفر در گونه‏های تریکودرما است. ظرفیت 13 استرین تریکودرما جهت کلونیزه کردن ریشه‏ی گوجه‏فرنگی و تحریک کردن رشد گیاه مورد ارزیابی قرار گرفت. تمام استرین‏های استفاده شده با موفقیت در اسپرموسفر تکثیر یافتند و رشدشان را در ریزوپلان همراه با رشد ریشه‏ها ادامه دادند. بالاترین جمعیت در قسمت‏های انتهائی ریشه مربوط به استرین‏های t6 و t7 بود. کلونیزاسیون ریشه در اغلب استرین‏ها توام با افزایش رشد ریشه‏ها و اندام هوائی بود جائیکه استرین‏ها بطور معنی‏داری تا میزان 43 و 40 درصد به ترتیب وزن خشک ریشه‏ها و اندام هوائی را افزایش دادند. تکنیک نمایش افتراقی تکثیر نسخه‏های معکوس mrna (differential display reverse transcriptase-pcr) استفاده شد تا ژن‏های متمایز بیان شده‏ی استرین trichoderma harzianum t7 (که در آزمون‏ قبلی انتخاب شده بود ) را در طول مراحل کلونیزاسیون بذور در حال جوانه‏زنی و ریشه‏های گوجه‏فرنگی ردیابی کند. تولیدات تکثیر‏یافته‏ی ddrt-pcr روی ژل ‏آگارز تفکیک شد و 62 باند افتراقی برش، خالص‏سازی، همسانه‏سازی و توالی‏یابی شد. قطعه‏توالی‏های بیان شده‏ی بدست آمده (ests) به پایگاه اطلاعات ژنوم ncbi معرفی و با استفاده از جستجوی blastx و نسب‏شناسی ژنی مورد ارزیابی کارکردی قرار گرفت. اغلب قطعه‏توالی‏های بیان شده با پروتئین‏های شناخته‏شده و فرضی همچون secretion-related small gtpase، 40s ribosomal protein s3a، 3-hydroxybutyryl-coa dehydrogenase، dna repair protein rad50، lipid phosphate phosphatase-related protein type 3، nuclear essential protein, phospholipase a2، fatty acid desaturase، nuclear pore complex subunit nup133، ubiquitin-activating enzymeو 60s ribosomal protein l40 مرتبط شناخته شدند. همچنین، 13 تا از این قطعه‏توالی‏های بیان شده هیچ گونه شباهتی با توالی‏های موجود در پایگاه‏های اطلاعات ژنوم نشان ندادند (e>.05) و به عنوان ژن‏های شناخته‏شده‏ی جدیدی از تریکودرما مد‏نظر قرار گرفتند. تعدادی از این قطعه‏توالی‏های بیان شده با ژن‏هائی که کدکننده‏ی آنزیم‏های درگیر در تامین غذائی میکروارگانیزم‏ها هستند مرتبط شناخته شدند. این ژن‏ها اهمیت آشکاری در استقرار تریکودرما در اسپرموسفر و ریزوسفر دارند زیرا به صورت بالقوه در بدست آوردن مواد غذائی قابل جذب از ترکیبات کربنی غنی از انرژی خارج شده از بذور در حال جوانه‏زنی و ریشه‏ها نقش دارند. ژن p23 که قبلا نقش محتمل آن در کلونیزاسیون ریشه گزارش شده است در استرین‏های t. reesei t6 و t. reesei tku70 با استفاده از خوانش‏های قدم به قدم توالی‏یابی شد. سپس، بیان آن بوسیله‏ی واکنش کمی real time pcr و با استفاده از rna استخراج شده از میسیلیوم‏ رشد کرده در شرایط کمبود ازت، گلوکز و برهمکنش‏یافته با ریشه گوجه‏فرنگی بررسی شد. کمبود ازت بیان p23 را کاهش داد در صورتیکه اختلاف معنی‏داری در بیان آن در شرایط کمبود یا میزان کافی گلوکز مشاهده نشد. همچنین بیان ژن در میسیلیوم‏های برهمکنش یافته با ریشه‏ها القاء شد. یک راهبرد حذف هدفدار ژن جهت تعیین وظیفه p23 در استرین مدل t reesei tku70 استفاده شد. جهت تخریب یا ناک‏اوت کردن این ژن، یک ساختمان انتقال حاوی ژن تخریب شدهp23 ساخته شد که در آن توالی‏های کامل کد‏کننده ژن p23 بوسیله‏ی ژن pyr4 بعنوان یک نشانگر گزینشگر اکسوتروف جایگزین شد.